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單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理
技術(shù)文章 2018-11-20

  單細胞測序主要涉及單細胞基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序兩個方面,分別針對單細胞DNA及RNA進行序列分析和比較。單細胞測序一直是科學家關(guān)注的一個熱點。單細胞基因組測序目前主要有兩種擴增方法:MALBAC方法及MDA方法,而單細胞轉(zhuǎn)錄組目前主要有三種方法:SMART擴增技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。

  今天主要和大家聊聊單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。要實現(xiàn)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,需要解決2個難題:

  1.PCR偏差:單個細胞含有約10pg total RNA,而約80%以上信息為rRNA,從單細胞RNA到文庫意味著核酸的擴增量要達到百萬倍以上。而在這個高的擴增量不引入PCR偏差一直是個較大的問題。 我們可以想一下,如果兩個樣本基因表達量是相同的,但擴增效率A是99%,B是97%,在擴增30個循環(huán)后,兩者在擴增后的表達就有了1.84(0.99^30/0.97^30)倍的差異。而當我們分析差異基因的時候如果選1.5倍作為差異基因的標準,那么本來沒有差異的基因也會出現(xiàn)差異。

  2.去除rRNA:rRNA(核糖體RNA)在total RNA占比一般在80%以上,如果不加區(qū)分地進行逆轉(zhuǎn)錄,再擴增、建庫很可能測序得到的絕大部分序列都是rRNA的序列,但是一般情況下,如果你更關(guān)心mRNA等編碼基因的序列,rRNA序列不能給我們帶來有效的信息,可以說它是無用的。

     下面我們來分別介紹單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的三個擴增技術(shù):

  SMART擴增技術(shù):

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理


  SMART擴增技術(shù)的核心技術(shù)就是設(shè)計了2個特殊的引物。再配合用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。

  特殊引物1由中間PolyT序列加上一段通用序列及3末端兩個簡并堿基構(gòu)成,但在PolyT的3端倒數(shù)第二個堿基是A、C、G而非T的簡并堿基,而倒數(shù)第一個為簡并堿基,這樣做的好處是讓它正好結(jié)合在mRNA的3端連到Poly(A)尾巴的這個連接處,而不會結(jié)合到mRNA的別的地方。這樣就保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3端的序列終止位置。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,這個酶有個特點,就是它在轉(zhuǎn)錄到mRNA的5端末端的時侯,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,會在新合成的cDNA的3末端,多加出幾個C堿基來。

  特殊引物2由一段通用序列及它的3端是3個非脫氧的G堿基構(gòu)成,也就是核糖核酸的、RNA的G堿基,而不是DNA的G堿基,這個引物可以與剛才新合成的cDNA的3端的那幾個C堿基發(fā)生互補雜交,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,然后引導這個MMLV酶再次發(fā)揮聚合作用,以剛才那條新合成的cDNA為模板,復制的結(jié)果,就是得到雙鏈的cDNA。

  這個雙鏈cDNA,兩端都已經(jīng)接好了我們?nèi)斯ぴO(shè)計的PCR引物序列,然后,就加入常規(guī)的PCR引物,進行常規(guī)的PCR擴增,常規(guī)PCR擴增,得到大量DNA。然后可以象常規(guī)的DNA建庫那樣,超聲打斷、建庫、上機測序了。

  通過SMART技術(shù)得到的主要是mRNA信息,LncRNA信息大部分會丟失,SMART技術(shù)對于RNA的質(zhì)量要求較高,如果RNA出現(xiàn)降解會導致mRNA 5端信息丟失。通用引物技術(shù)能保證擴增的均一性,但PCR引入的突變不能夠分析出來單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。


單細胞轉(zhuǎn)錄組測序,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)


  10×genomics技術(shù):

  首先再凝膠微珠上種上特定的DNA片段,DNA片段由三部分組成:Barcode、UMI、PolyT組成。Barcode是16個堿基的長度。一共有400萬種Barcode,一個微珠是對應于一種Barcode,通過這400萬種Barcode,可以把凝膠微珠給區(qū)分開。UMI是一段隨機序列,也就是說每一個DNA分子,都有自己的UMI序列。10個堿基長的UMI,有100萬種序列的變化(4^10 = 1,048,576),UMI的作用是為了區(qū)分哪些哪些reads是來自于一個原始cDNA分子,區(qū)分基因片段重復還是duplication及區(qū)分是真實的SNP位點還是PCR產(chǎn)生的突變。

  通過10×genomics儀器將單個細胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起,形成油包水的小微滴,接下來把細胞膜破掉,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序讓細胞當中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合,也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸。

  接著,發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應。mRNA與凝膠微珠上帶標簽的DNA分子相結(jié)合,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來。把這個乳濁液當中所有的水相抽出來,也就是把所有帶了標簽的cDNA分子都抽出來,再把這些cDNA分子都加上接頭,經(jīng)過PCR擴增,做成illumina的測序文庫,放到Illumina的測序儀上進行測序。測序完成之后,進行數(shù)據(jù)分析。

  10×genomics技術(shù)一次可以同時得到大量大細胞數(shù)據(jù),但只能得到mRNA信息,LncRNA大部分信息丟失,UMI技術(shù)能很好去除認為分析引入duplication及PCR引入SNP位點。同樣對RNA質(zhì)量要求高,降解同樣會引起5端信息丟失。

  Anydeplete技術(shù):

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理

   

  Anydeplete技術(shù)首先通過隨機引物進行一鏈合成,一鏈合成引入核苷酸類似物,用于酶切打斷,二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭,接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物,用于酶切降解。當形成單鏈文庫后,設(shè)計特異性引物與rRNA形成文庫結(jié)合,一輪退貨延伸,rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。Reverse adaptor上帶有特異的酶切位點,當形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點被識別,切去接頭,這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭,而其他文庫帶有完整接頭,通過PCR擴增富積既能得到想要的信息,包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序一樣,包含分子標簽,可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點。

  Anydeplete技術(shù)能夠用于降解性樣本,保證5端及3端信息的完整,能同時得到mRNA及LncRNA信息,如果只希望得到mRNA信息,Anydeplete技術(shù)則會引起一部分數(shù)據(jù)浪費。

  總結(jié): SMART技術(shù)可用于單細胞mRNA測序,對RNA質(zhì)量要求高,RNA降解會引起5端信息丟失,沒有分子標簽功能。 10×genomics技術(shù)可用于單細胞mRNA測序,對RNA質(zhì)量要求高,RNA降解會引起5端信息丟失,有分子標簽功能。 Anydeplete技術(shù)可用于單細胞mRNA及LncRNA測序,對RNA質(zhì)量要求不高,可用于降解性樣本單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。


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