2016年,10x Genomics公司推出ChromiumTM系統(tǒng),這是一套分子條形碼和分析系統(tǒng),由儀器、試劑盒和信息學(xué)軟件組成,能夠?qū)覫llumina測序儀。
作為單細(xì)胞測序單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序領(lǐng)域的黑馬,10x Genomics這款基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞系統(tǒng),可同時(shí)獲得1000-10000個(gè)細(xì)胞的表達(dá)信息,實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測,是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、免疫細(xì)胞群體檢測以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法。
-應(yīng)用方向-
10x Genomics單細(xì)胞應(yīng)用廣泛,可應(yīng)用的細(xì)胞類型有:生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、其他原代細(xì)胞。
主要的應(yīng)用方向有:
(1)人類細(xì)胞圖譜構(gòu)建
可以對人體各種細(xì)胞進(jìn)行測序,獲得人體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序圖譜,并基于基因表達(dá)將細(xì)胞分類,定義新的細(xì)胞,繪制所有細(xì)胞及其分子的空間組織方式,探索人體各個(gè)器官細(xì)胞復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)在單個(gè)細(xì)胞中的運(yùn)作機(jī)制,并了解各個(gè)細(xì)胞中這些網(wǎng)絡(luò)的差異,以及各種細(xì)胞群體是如何協(xié)同工作。
(2)腫瘤異質(zhì)性研究
進(jìn)行腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性研究、腫瘤細(xì)胞分群以及新類型單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),尋找新的致病途徑和機(jī)制。
(3)干細(xì)胞發(fā)育以及分化
對同種干細(xì)胞剖析細(xì)胞異質(zhì)性,鑒定不同表型的細(xì)胞,尋找不同類型干細(xì)胞的特異性標(biāo)記(marker),解析干細(xì)胞發(fā)育和分化的分子機(jī)理。
(4)免疫方向研究
分析免疫細(xì)胞遺傳物質(zhì)的多樣性以及病原體導(dǎo)致免疫細(xì)胞的高度異質(zhì)性,從而理解機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制;并且可以鑒定稀有的免疫細(xì)胞類型,發(fā)現(xiàn)新的marker基因,便于更深層次地挖掘免疫細(xì)胞以及研究免疫反應(yīng)的分子機(jī)理。
(5)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究
研究不同的神經(jīng)元細(xì)胞的異質(zhì)性以及神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞分群情況,進(jìn)一步神經(jīng)元細(xì)胞是如何從神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生分子調(diào)控機(jī)制,將會有助于我們了解疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
(6)腦發(fā)育研究
可以獲得人腦細(xì)胞基因表達(dá)的圖譜,解析人腦細(xì)胞的異質(zhì)性,獲得人腦細(xì)胞的復(fù)雜的細(xì)胞類群,可以幫助我們更好地理解人腦正常功能及異常單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
(7)胚胎細(xì)胞發(fā)育研究
可以細(xì)胞不同亞型的特征進(jìn)行研究,構(gòu)建細(xì)胞譜系,預(yù)測分化方向單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
(8)疾病分型
用于發(fā)現(xiàn)發(fā)生異常增殖的細(xì)胞類型,結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)特征,輔助疾病分型單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
以下,列出目前所有應(yīng)用10x Chromium平臺,已發(fā)表的案例文章。
-技術(shù)原理-
10x Genomics儀器小巧,但功能強(qiáng)大,具有通量高、靈活性強(qiáng)、流程簡單、技術(shù)性能高、單個(gè)細(xì)胞制備成本低等優(yōu)勢,其技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠(GEM),該系統(tǒng)有75萬種barcoded beads,每個(gè)bead上有40-80萬探針。
技術(shù)要點(diǎn)
> 8通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)
> 含Barcoded RT Primers的Gel Beads、細(xì)胞和酶的混合物、油
> 三者結(jié)合形成GEMs,即包裹Gel Beads、細(xì)胞和酶的混合物的油滴
> GEMs被收集(單細(xì)胞捕獲率≈65%)
技術(shù)流程
GEM形成后,細(xì)胞裂解,凝膠珠自動溶解釋放大量barcode序列,隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。
油滴破碎,cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行cDNA打斷、加測序接頭P5及測序引物R1等傳統(tǒng)二代測序的建庫過程單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
測序后,得到每個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)譜,Barcode標(biāo)記細(xì)胞,UMI標(biāo)記基因并記錄表達(dá)量。
-數(shù)據(jù)分析-
Cell RangerTM分析流程,是10x Genomics針對ChromiumTM單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)的完整分析流程,結(jié)合轉(zhuǎn)錄比對數(shù)據(jù)和標(biāo)示細(xì)胞的barcode信息,該流程能進(jìn)行細(xì)胞聚類、差異基因篩選、差異基因功能分析。
10x Genomics作為單細(xì)胞領(lǐng)域的后起之秀,巧妙使用了Barcoding(條形碼)和Microfluidics(微流體)技術(shù),在單細(xì)胞分離、擴(kuò)增原理上具有明顯的優(yōu)勢。當(dāng)然,10x Genomics ChromiumTM系統(tǒng)也在不斷升級;近期推出的單細(xì)胞V(D)J測序,能夠有效的分析100-100,000個(gè)人類T細(xì)胞的全長配對V(D)J轉(zhuǎn)錄本。我們相信,在單細(xì)胞測序技術(shù)幫助下,我們能更深入的理解基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。