單細(xì)胞測(cè)序樣本制備儀，基于Drop-seq技術(shù)*，完成高通量的單細(xì)胞mRNA 3’端測(cè)序。關(guān)于單細(xì)胞RNA測(cè)序的技術(shù)教程講解，以下是我們整理的講解。
傳統(tǒng)“批量的”RNA測(cè)序方法可以一次處理成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并得到變異的平均水平。但是沒(méi)有兩個(gè)細(xì)胞是完全相同的，而scRNA-seq則可以揭示出每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特的微妙變化，甚至可以揭示全新的細(xì)胞類(lèi)型。
例如，在使用scRNA-seq技術(shù)檢測(cè)了約2,400個(gè)免疫細(xì)胞后，位于馬薩諸塞州劍橋市Broad研究所的Aviv Regev及其同事發(fā)現(xiàn)了一些具有強(qiáng)大T細(xì)胞刺激活性的樹(shù)突細(xì)胞，一種能夠刺激這些細(xì)胞的疫苗可能會(huì)潛在地增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，并預(yù)防癌癥。
這些發(fā)現(xiàn)來(lái)之不易，操縱單個(gè)細(xì)胞比大群體要困難得多，而且因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞只產(chǎn)生少量的RNA，所以沒(méi)有任何犯錯(cuò)的余地。此外，另一個(gè)問(wèn)題是如何分析海量數(shù)據(jù)產(chǎn)生的結(jié)果，因?yàn)槲覀兡壳八褂玫墓ぞ呖赡懿皇侵庇^的。
通常，研究人員需要費(fèi)力地在Unix操作系統(tǒng)中鍵入命令來(lái)分析RNA-seq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)文件會(huì)從一個(gè)軟件包傳遞到下一個(gè)軟件包，每個(gè)工具包在這個(gè)過(guò)程中處理其中一個(gè)步驟：基因組比對(duì)、質(zhì)量控制、變異分析等。
這個(gè)過(guò)程十分復(fù)雜，但是對(duì)于“批量的”RNA-seq來(lái)說(shuō)，至少已經(jīng)形成了一種共識(shí)，即每一步哪種算法適合，以及它們?nèi)绾芜\(yùn)行。因此，現(xiàn)在已經(jīng)有了基本的流程，雖然仍有待調(diào)整，但至少對(duì)非專(zhuān)家來(lái)說(shuō)是可處理的。在分析基因表達(dá)的差異方面，英國(guó)癌癥研究所計(jì)算生物學(xué)家Aaron Lun表示，RNA-seq的問(wèn)題目前來(lái)說(shuō)已基本解決。
但對(duì)于scRNA-seq來(lái)說(shuō)，我們還不能妄言已經(jīng)解決：研究人員仍然在探索可以用數(shù)據(jù)集做什么、哪些算法是有用的。
但是一系列在線資源和工具正在簡(jiǎn)化scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的過(guò)程。在GitHub網(wǎng)站上，一個(gè)名為“Awesome Single Cell”的頁(yè)面收錄了70多種工具和資源，涵蓋了分析過(guò)程的每個(gè)步驟。西雅圖華盛頓大學(xué)的生物學(xué)家Cole Trapnell說(shuō)，該領(lǐng)域已經(jīng)催生了計(jì)算生物學(xué)工具的小型產(chǎn)業(yè)。
夏威夷大學(xué)的生物信息學(xué)家Lana Garmire，在去年發(fā)表的一篇評(píng)論中列出了scRNA-seq數(shù)據(jù)分析以及約48項(xiàng)工具的基本步驟。盡管每個(gè)實(shí)驗(yàn)都不盡相同，但大多數(shù)分析流程都遵循著相同的步驟來(lái)清理和篩選測(cè)序數(shù)據(jù)，找出哪些轉(zhuǎn)錄子可以表達(dá)，并且對(duì)于擴(kuò)增效率的差異是正確的。研究人員隨后進(jìn)行一項(xiàng)或多項(xiàng)二級(jí)分析，以檢測(cè)亞群和其他功能。
Christina Kendziorsk，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家說(shuō)到，在許多情況下，大規(guī)模RNA-seq中使用的工具也可以應(yīng)用于scRNA-seq。但數(shù)據(jù)的根本差異意味著，這并不總是可行的。Lun表示，一方面，單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的背景噪聲更大。在如此少量RNA的情況下，擴(kuò)增和捕獲效率的微小變化，就可能在細(xì)胞間產(chǎn)生與生物學(xué)無(wú)關(guān)的巨大差異。因此，研究人員需要對(duì)“批量效應(yīng)”保持警惕，因?yàn)樵诓煌掌谥苽涞目此葡嗤募?xì)胞，可能因?yàn)榧兇獾募夹g(shù)原因而不盡相同，導(dǎo)致“中途退出”的基因在細(xì)胞中表達(dá)，但在測(cè)序的數(shù)據(jù)中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
澳大利亞悉尼心臟研究所的生物信息學(xué)家Joshua Ho也談道，另一個(gè)挑戰(zhàn)是規(guī)模。典型的大規(guī)模RNA-seq實(shí)驗(yàn)涉及的樣品數(shù)量較少，但scRNA-seq研究可能涉及數(shù)千個(gè)樣本。能夠?qū)κ畮讉€(gè)樣本進(jìn)行處理的工具在遇到10倍或100倍數(shù)目的樣本時(shí)，處理速度往往會(huì)十分緩慢。
此外，即使是看似簡(jiǎn)單的問(wèn)題，如一個(gè)良好的細(xì)胞制備是如何構(gòu)成的，在scRNA-seq的領(lǐng)域里也很復(fù)雜。Lun的工作流程假定大多數(shù)細(xì)胞具有大致相當(dāng)?shù)腞NA豐度。但他表示，“這種假設(shè)并不一定是正確的”。例如，他談道，從未被抗原激活并且相對(duì)靜止的初始T細(xì)胞往往比其他免疫細(xì)胞具有更少的信使RNA，并且在分析過(guò)程中可能會(huì)被移除，因?yàn)槌绦蛘J(rèn)為沒(méi)有足夠的RNA來(lái)進(jìn)行處理。
或許重要的是，執(zhí)行scRNA-seq的研究人員傾向于從分析大量RNA的問(wèn)題中提出不同的問(wèn)題。“批量”的分析通常是研究基因表達(dá)在兩種或多種治療條件之間的區(qū)別。但是，研究單個(gè)細(xì)胞的研究人員通常旨在識(shí)別新的細(xì)胞類(lèi)型或狀態(tài)，或重建細(xì)胞的發(fā)育途徑。Lun強(qiáng)調(diào)：“因?yàn)槟繕?biāo)是不同的，所以這就需要一套不同的工具來(lái)分析數(shù)據(jù)。”
例如，單細(xì)胞分析的一種常見(jiàn)類(lèi)型是維數(shù)約簡(jiǎn)。該過(guò)程簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)集，以便于識(shí)別類(lèi)似的細(xì)胞。據(jù)英國(guó)劍橋研究所的計(jì)算生物學(xué)家Martin Hemberg所說(shuō)，scRNA-seq數(shù)據(jù)將每個(gè)細(xì)胞表示為“20,000個(gè)基因表達(dá)值的列表”。 主成分分析(PCA)和t分布式隨機(jī)相鄰嵌入(t-SNE)等維度降低算法，有效地將這些特征投射到二維或三維中，使得相似的細(xì)胞簇易于分辨。另一個(gè)流行的應(yīng)用程序是偽時(shí)間分析。2014年，Trapnell開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為“Monocle”的工具。Trapnell表示，這款機(jī)器學(xué)習(xí)軟件從scRNA-seq實(shí)驗(yàn)推斷出伴隨細(xì)胞分化的基因表達(dá)變化序列，這就像從空中拍攝跑步者的路徑一樣。
此外，其他工具解決了亞群檢測(cè)(例如，波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院Peter Kharchenko開(kāi)發(fā)的Pagoda)和空間定位的問(wèn)題，其使用了關(guān)于組織中基因表達(dá)分布的數(shù)據(jù)來(lái)確定每個(gè)轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生自哪里。Rahul Satija工作于紐約基因組中心，他開(kāi)發(fā)一種這樣的工具，名為“Seurat”。他表示，該軟件利用這些數(shù)據(jù)，將細(xì)胞定位為三維空間中的點(diǎn)?！斑@就是為什么我們將其命名為Seurat(Seurat為法國(guó)印象派畫(huà)家，在繪畫(huà)技法上運(yùn)用畫(huà)筆一筆一筆點(diǎn)在畫(huà)面，這種作品被稱(chēng)為點(diǎn)彩畫(huà))?！彼忉屨f(shuō)，“因?yàn)檫@些點(diǎn)讓我們聯(lián)想起了一副點(diǎn)彩畫(huà)?！?/p>
盡管針對(duì)特定的任務(wù)，這些工具通常涉及多種功能。例如，Rahul Satija的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)Seurat進(jìn)行了細(xì)胞亞群分析，以識(shí)別新的免疫細(xì)胞。
加州大學(xué)圣地亞哥分校的生物信息學(xué)家Gene Yeo談道，大多數(shù)的scRNA-seq工具都是基于R語(yǔ)言的Unix程序或軟件包編程的，但相對(duì)而言，很少有生物學(xué)家在這些環(huán)境中工作。即便是這樣，他們也可能沒(méi)有時(shí)間下載和配置所有工作，使這些工具發(fā)揮作用。
目前，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些即用型的流程。還有端到端的圖形工具，包括來(lái)自FlowJo的商業(yè)化GenSeq軟件包，以及一對(duì)開(kāi)源的Web工具：來(lái)自Garmire集團(tuán)的Granatum和來(lái)自瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Bart Deplancke實(shí)驗(yàn)室的ASAP(自動(dòng)單細(xì)胞分析流程)。
ASAP和Granatum使用Web瀏覽器提供相對(duì)簡(jiǎn)單的交互式工作流程，使研究人員能夠以圖形的方式探索數(shù)據(jù)。用戶(hù)上傳了他們的數(shù)據(jù)后，軟件會(huì)逐步走完他們的步驟。對(duì)于ASAP，這意味著通過(guò)可預(yù)處理、可視化、聚類(lèi)和基因表達(dá)差異分析獲取數(shù)據(jù);Granatum還允許偽時(shí)間分析和蛋白質(zhì)交互作用數(shù)據(jù)的整合。
Garmire和Deplancke也都表示，ASAP和Granatum旨在讓生物信息等多個(gè)領(lǐng)域的研究人員共同合作。研究人員曾經(jīng)認(rèn)為，“(生物信息學(xué)家)獲取數(shù)據(jù)并產(chǎn)生結(jié)果是十分神奇的，”夏威夷大學(xué)博士生、Granatum的開(kāi)發(fā)人員Xun Zhu表示，“現(xiàn)在研究人員可以參與一些參數(shù)的調(diào)整，這是一件好事。”
當(dāng)然，這些工具也存在一定問(wèn)題。例如，在識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型方面性能優(yōu)異的工具可能會(huì)因偽時(shí)間分析而出現(xiàn)問(wèn)題。此外，加州大學(xué)伯克利分校生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家Sandrine Dudoit強(qiáng)調(diào)，合適的方法是“非常依賴(lài)于數(shù)據(jù)集的”。這可能需要對(duì)方法和參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以考慮諸如測(cè)序長(zhǎng)度之類(lèi)的變量。但Marioni談道，重要的是不要完全信任這些流程，他打比方說(shuō)：“就像衛(wèi)星導(dǎo)航告訴你開(kāi)車(chē)進(jìn)入河流，但你可不能真開(kāi)進(jìn)河里?！?/p>
對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)，保持謹(jǐn)慎的態(tài)度是有道理的。生物信息學(xué)工具幾乎總是能給出答案;但問(wèn)題是，這些答案究竟意味著什么?Dudoit的建議是進(jìn)行一些探索性的分析，并驗(yàn)證你所選擇算法的假定條件是有意義的。
Satija還談道，一些分析任務(wù)仍然頗具挑戰(zhàn)性，如在不同實(shí)驗(yàn)條件或生物體間進(jìn)行比較，并整合不同組學(xué)的數(shù)據(jù)。
但是，目前的工具已經(jīng)基本滿(mǎn)足了大多數(shù)研究人員的需求。Kendziorski建議那些感興趣的研究人員可以深入了解。每一種新的工具都可以揭示生物學(xué)的另一個(gè)方面，只要你關(guān)注科學(xué)，并做出明智的選擇。
凈信誠(chéng)邀各大測(cè)序公司及技術(shù)服務(wù)公司一起合作，為單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展貢獻(xiàn)力量。有合作意向請(qǐng)撥打：021-57790908，郵箱：zhujianming0374@163.com
轉(zhuǎn)摘請(qǐng)注明出處：謝謝配合
滬公網(wǎng)安備31011702889603號(hào) 網(wǎng)站地圖